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山羊精液冷冻保存研究现状、存在问题及展望
阅读次数:759   发布时间: 2016/2/1 16:06:57   文章来源:  

山羊精液的冷冻保存对于山羊遗传资源的长期保存和辅助繁殖技术研究具有重要的意义。我国山羊冻精技术的研究是从80年代才开始,到目前为止,在大多数的试验中,山羊冻精解冻后的活率不能稳定地超过50%[1]。山羊精液在冷冻过程中要面临诸多挑战,主要包括温度变化冲击、渗透损伤、化学毒性损伤、氧化损伤、细胞凋亡、细胞内外冰晶的机械损伤等。另外,山羊精液中含有一种EYCE,这种酶可以和蛋黄发生相互作用,并最终导致精子的死亡,而其他家畜,如牛、猪和绵羊则缺少这种酶[2,3]。本文拟从山羊精浆的处理、主要冷冻保护剂的筛选、精液稀释和低温冷却、冷冻保存以及解冻等方面对目前山羊精液保存研究的现状进行综述,并对目前山羊精液冷冻保存中存在的问题进行深入分析,最后对山羊精液冷冻保存技术的发展前景进行初步的预测。
1 山羊冷冻保存研究现状
1.1山羊精浆的处理
山羊精液冷冻保存的一个难点是如何去除精液中EYCE对精子的不利影响。1957年Roy首先发现山羊精浆会导致蛋黄聚集,并最终引起精子的死亡[3]。随后证明这种聚集作用是由一种来源于尿道球腺的蛋白酶引起的,并将这种蛋白酶命名为EYCE。60年代,研究人员将该酶定性为磷脂酶A[2]。EYCE可以将蛋黄中的卵磷脂水解为脂肪酸和溶血卵磷脂,导致质膜的通透性增加,最终诱发顶体反应和染色体解聚[4],而这些结构变化都不利于冷冻精子的存活。
为了克服山羊精液中的EYCE的不利影响,传统的做法是将新鲜精液和不含蛋黄的稀释液混合而后离心去除精浆。通常精子离心洗涤次数为1-2次,重力加速度为550-950g,离心时间为10-15min[4,5]。目前关于山羊精液冷冻是否需要去除精浆的做法仍然存在一定的争议,但是大多数研究支持冷冻前去除精浆的做法。研究表明,去除精浆对提高冷冻精子的存活率和维持精子的顶体完整性具有非常重要的意义[4,5]。然而,其他一些研究表明,冷冻前不去除精浆也可以获得较好的精子活率[5,6]。但是在这些研究中,精液稀释液中的蛋黄浓度通常在5%以下。另外,其他一些研究者通过添加BUSgp60脂酶抑制剂、采用脱脂奶粉代替蛋黄、或者采用非牛奶来源的奶粉来代替蛋黄,从而消除精浆中EYCE带来的不利影响[7]。最后,研究者也在探讨不采用蛋黄和奶粉的、化学成分明确的精液稀释液的保护效果,目前的研究主要集中于大豆卵磷脂[7-9]和高分子聚合物[11-13]。
1.2主要冷冻保护剂的筛选
1.2.1 蛋黄
自从1939年Philips首先发现蛋黄对公牛精子的保护作用后,蛋黄已经广泛应用于哺乳动物精液的冷冻保存研究[14]。但是由于蛋黄成分复杂,到底蛋黄中哪些成分可以提高精子对冷冻的耐受性仍然不确定。1974年,Pace和Graham首先揭示蛋黄中的低密度脂蛋白应该是提高精子冷冻耐受性的主要成分[15]。但是对于低密度脂蛋白保护精子免受冷冻损伤的作用机制仍然不明确。一些研究认为低密度脂蛋白可以直接吸附到精子质膜上,通过形成一层保护膜来保护冷冻精子质膜的完整性[16]。另外一些研究表明,低密度脂蛋白可以代替精子质膜在冷冻过程中损失的磷脂[17]。
但是蛋黄的采用仍然存在缺陷。首先,蛋黄成分过于复杂,这直接导致精液稀释液化学成分的不确定性,这可能也是导致山羊精液冷冻结果差异较大的一个原因。其次,蛋黄的采用也增加了稀释液被细菌污染的机会。第三,由于山羊精液中含有EYCE,其可以和蛋黄发生不利于精子存活的相互作用。
1.2.2 糖类
山羊精子可以利用果糖、葡萄糖以及其他的糖类作为代谢底物。糖类不但可以为精子提供能量,而且也可以为精子提供渗透平衡和冷冻保护作用。但是精液稀释液中到底添加哪一种糖类,是由糖类的性质和作用所决定的。果糖是山羊精浆中糖酵解的主要底物,而作为果糖的替代者,葡萄糖也是山羊精子代谢的有效底物。山羊精液冷冻前需要去除精浆,这导致精液中大部分糖类的流失,因此在山羊精液稀释液中需要添加一定浓度的果糖或葡萄糖作为精子的代谢底物。Corteel的实验表明,当稀释液中含葡萄糖时,冷冻精子的活率在30%左右;而当精液稀释液中不含葡萄糖时,冷冻精子的活率仅为10%左右[18]。
除了单糖以外,还有其他的寡聚糖,如海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、以及棉子糖等,也可以作为精液稀释液的保护成分[4]。但是,需要指出的是,寡聚糖在正常生理条件下无法进入细胞内,因此它们只能在细胞外对细胞提供保护作用。Aboagla和Terada采用海藻糖作为保护剂冷冻保存山羊精子。结果表明,随着海藻糖浓度的升高,冷冻精子的活率呈逐步增加的趋势,而且海藻糖也可以有效保护精子的质膜和顶体完整性[19]。但是关于海藻糖等寡聚糖对冷冻精子的保护机制尚不清楚。首先,寡聚糖的添加可以导致精子脱水,从而降低了冷冻过程中细胞内冰晶的形成;另外,寡聚糖的添加增加了细胞外溶质的浓度,从而降低了保护体系的结晶点,在一定程度上也降低了外源冰晶对精子的损伤。其次,寡聚糖含有一定数目的羟基,在冷冻条件下,这些基团可以代替水分子以氢键的形式和质膜磷脂上的极性基团发生作用,从而避免冷冻过程中质膜由稳定的液晶相变为不稳定的凝胶相,最终降低了磷脂相变对精子的不利影响。另外一些研究认为,寡聚糖可以插入到精子质膜中,从而防止冷冻过程中精子的过度脱水,降低冷冻过程中由于精子体积变化所引起的理化损伤。最后,寡聚糖的添加也可以降低渗透性保护剂对细胞的渗透损伤[4]。
1.2.3渗透性保护剂
应用于哺乳动物精子冷冻保存的渗透性保护剂主要包括甘油、二甲亚砜、乙二醇和丙二醇等,其中最常用的保护剂是甘油。渗透性保护剂的主要优点是易于通过细胞膜,可以在细胞膜内外同时发生作用。在渗透性保护剂存在的条件下,首先由于高渗导致精子脱水,而后随着渗透性保护剂进入细胞内,最终使细胞内外渗透性保护剂浓度相同。此时细胞内的部分水分被渗透性保护剂代替,降低了细胞内液的结晶点,因此也就抑制了内源性冰晶的形成。另外,渗透性保护剂也可以引起质膜蛋白和脂类的重排,从而提高了精子质膜的流动性和低温下更高的脱水效率[4]。
但是,渗透性保护剂仍然会对精子造成一定的渗透和化学毒性损伤。渗透性保护剂导致的细胞脱水对于降低冷冻过程中细胞内冰晶的形成具有重要意义,但是当细胞收缩到某一极限体积时,就会对精子造成不可逆的损伤,最终导致精子死亡。为了避免精子细胞的过度脱水,可以在保护体系中添加非渗透性保护剂,如寡聚糖等,来降低渗透性保护剂对细胞的渗透损伤。其次,渗透性有机溶剂也会对细胞造成一定的化学毒性影响。通常,渗透性保护剂,主要是甘油、乙二醇和二甲亚砜的使用浓度范围在1%-8%[4]。根据文献报道,甘油的毒性要低于二甲亚砜和乙二醇。Kundu et al发现当单独使用6%(V/V)的甘油作为保护剂冷冻保存山羊精子时,解冻后精子活率(约35%)明显高于单独使用乙二醇或二甲亚砜作为保护剂时的精子活率(13%和21%)[13]。而为了提高细胞内渗透性保护剂的浓度和缩短低温平衡时间,一些研究将甘油和其他渗透性较高的保护剂如乙二醇或二甲亚砜联合作为山羊精子的保护剂,也获得了较好的冷冻保护效果。Kundu et al的实验表明,单独使用甘油或二甲亚砜作为保护剂时,冷冻后的精子活率分别为33%和15%,但是当联合采用甘油和二甲亚砜作为保护剂时,其解冻后的精子活率可以提高到45%,这表明在山羊精子冷冻保护方面,渗透性有机溶剂之间存在着一定的协同作用[14]。
1.3精液稀释和低温冷却
通常,冷冻前精液和稀释液混合后要在4-5℃冰箱内冷却1.5h-4h。目前主要有两种冷却方法。一种是将离心去除精浆的精子直接按照一定比例和含有甘油等渗透性保护剂的稀释液混合,而后用多层纱布包裹,于5℃冰箱内冷却一定时间,然后进行冷冻。而另一种方法是首先将精子和不含甘油等渗透性有机溶剂的稀释液混合,并在5℃冰箱内冷却一定时间,然后再和含有甘油等渗透性有机溶剂的稀释液混合,在5℃冰箱内短时间平衡后再进行冷冻保存。第一种方法操作简单,但是精子和甘油等保护剂接触的时间较长,可能会对精子产生一定渗透和毒性损伤;而第二种方法操作比较复杂,对低温条件要求较高,但是由于精子直接和甘油接触的时间短,因此可以降低甘油对精子的渗透和毒性损伤。两种方法各有优劣,研究者可以根据自己的实际情况选择合适的冷却方法。但是,在4-5℃条件下长时间的低温处理可能会对精子质量产生不利的影响。由于在低温下精子的呼吸活动仍然在进行,因此不可避免地导致活性氧产物的积累,最终可能对精子质膜造成氧化损伤。另外,山羊精液冷冻前需要离心去除精浆,但这同时也导致精液自身的抗氧化成分大量流失,因此相对于其他家畜而言,山羊精子更易受到氧化损伤。
1.4冷冻保存和解冻
山羊精液的冷冻程序包括预冻和投入液氮冷冻两个环节。首先稀释后的精液在干冰、液氮蒸汽或程控降温仪中预冻,然后再将精液直接投入液氮长期保存。通常的精液冷冻保存形式包括颗粒式和细管(0.25ml和0.5ml)式。以颗粒的形式冷冻保存山羊精液操作速度快、费用便宜,但是缺点是精液颗粒无法标记,而且容易污染。精液稀释冷却后,将精液以每滴0.1ml-0.3ml的体积滴加到干冰上预冻2-4min,然后投入液氮保存。细管冷冻法比颗粒冷冻法操作复杂,但是细管容易标记,便于精液库存管理。精液稀释冷却后,进行装管,然后再将细管置于液氮蒸汽中预冻。预冻时间和精液细管距离液氮表面的高度有关。装有液氮的泡沫箱或者程控降温仪都可以用来控制降温速度。当使用泡沫箱的时候,将放有精液细管的金属支架置于液氮表面3-4cm,在液氮蒸汽中熏蒸7-8min,然后将细管直接投入液氮长期保存。然而,需要指出的是预冻高度和时间并不是固定的,一些研究采用距离液氮液面4-5cm,熏蒸4-5 min,也取得较好的冷冻效果[7]。另外,程控降温仪冷冻法也可以代替颗粒冷冻法,即先将精液细管置于-80℃预冻7-15 min,然后直接投入液氮保存。程控降温仪的最大优点是可以将降温程序标准化。
Ritar et al的实验表明,与细管冷冻法相比,颗粒冷冻法获得的山羊精子活率较高,在39%左右;而采用0.25ml塑料细管冷冻保存的精子活率(33%)和采用0.5ml细管保存的精液活率(34%)差别不大[20]。Ritar认为造成不同方法冷冻精子活率和受精效果差异的主要原因是细管和颗粒的降温速率不同[20]。
冷冻精液解冻的方法主要由精液的冷冻方法所决定的。颗粒法冷冻保存的精液一般要在37℃的干燥试管内解冻,或者将精液颗粒取出后直接投入37℃稀释液中溶解;而细管冷冻法保存精液的解冻方法则存在多种形式。通常,研究人员将冷冻细管直接投入37℃的水浴中12-30s进行解冻。另外杨素芳等发现冷冻山羊精液的解冻温度以40-50℃为宜[1],但相应地,解冻时间也应该大幅缩短。
2 山羊精液冷冻保存中存在的问题
2.1 国内外至今尚未建立一种能满足实际生产需要的、适合大多数品种山羊精液的标准化冷冻程序,而且国内外研究所获得的实验结果差异也较大,这可能与精子活力的判定方法有关。例如,国内多数研究采用传统的显微镜目测方法分析精子活力,而国外主要采用自动化精子分析仪进行精子质量评价,这种方法在一定程度上消除了人为的主观性影响。但是,在实际科研和生产中最好将上述两种方法结合起来评判精液质量。
2.2 尽管蛋黄已经广泛应用于哺乳动物精液的冷冻保存研究中,并获得较好的冷冻保护效果。但是,蛋黄仍然具有很大的局限性,对山羊尤其如此。目前国内外主要通过离心洗涤的方法消除山羊精液中EYCE对精子的不利影响。寻求一种能够完全替代蛋黄的保护剂无疑是最佳选择。
2.3 山羊精液稀释后需要在低温(5℃)下长时间的平衡。但是这个低温平衡过程可能对冷冻精子的质量产生不利影响。除了甘油的直接影响外,由于低温下精子的呼吸作用并未完全停止,因此会造成活性氧产物的聚集,最终会对精子造成氧化损伤。
2.4 目前采用程控降温仪批量冷冻保存山羊精子的方法容易实现标准化。颗粒冷冻法由于其操作简单、价格低廉,而且解冻后精子活率较高,也易于在实际生产中推广,但是存在问题是无法进行标记。细管法冷冻克服了颗粒法的缺陷,但是操作繁琐,而且由于无法对金属支架进行精确控温,导致预冻条件无法标准化,这可能会造成冷冻效果的差异较大。
2.5对于精子的冷冻损伤机制仍未确定。尽管家畜精液冷冻保存研究已经开展了60多年,但是解冻后40%-70%的精子丧失了受精能力,这与我们对精子的冷冻损伤机制了解不足密切相关。目前,精子冷冻损伤研究基本处于细胞水平,而且这么多年关于精子冷冻损伤机制研究仍未取得实质性的进展,这已经严重制约了精子冷冻保存技术的进一步发展。
2.6目前山羊冷冻精子的质量评价体系仍然存在一定问题,常用的活力、运动速度、顶体和质膜完整性等指标并不能真实反映精子的受精能力,因此筛选可以反映精子冷冻敏感性的蛋白标志物对于进一步完善精子的质量评价体系非常重要。
3 展望
目前,鉴于山羊精液中含有对冷冻精子存活不利的EYCE,因此冷冻前去除精浆可能是必要的步骤。但是如果稀释液中蛋黄的浓度较低(<5%),也可以考虑不必去除精浆。要彻底解决这一问题,最好的办法是寻找一种可以代替蛋黄的保护剂,大豆卵磷脂和高分子聚合物是可以考虑的替代品。为了提高精子内渗透性保护剂浓度和缩短体外平衡时间,可以考虑联合采用甘油和其他渗透性较高的有机溶剂,如乙二醇和二甲亚砜联合作为保护剂。另外,在稀释液中添加抗氧化剂是降低活性氧对精子氧化损伤的必要措施。相对于细管冷冻法而言,颗粒冷冻法操作简单、价格便宜、解冻后活率较高。但是由于精液颗粒无法标记,这可能导致库存管理困难,因此推荐使用细管冷冻法保存山羊精液,而且根据目前的报道,颗粒冷冻法保存精液的情期受胎率和细管冷冻法之间无显著差别[4]。根据文献报道,预冻时金属支架应该距离液氮液面4cm,预冻时间为4-5min。解冻时应该将冷冻细管投入37℃水浴20-30s[3,20]。此外,目前国内外关于山羊精液冷冻保存的研究主要集中于精液稀释液保护成分的筛选和冷冻程序的优化等方面,而对于冷冻对山羊精子的损伤机制并未进行深入、系统的研究,下一步工作应该从精子超微结构、蛋白和核酸水平深入研究冷冻对山羊精子的影响机制。

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